Trimetazydyna – działanie, farmakokinetyka i zastosowanie w medycynie

Jakie są mechanizmy działania i farmakokinetyka trimetazydyny?

Trimetazydyna jest lekiem przeciwniedokrwiennym stosowanym w zapobieganiu lub leczeniu chorób serca, takich jak dławica piersiowa (brak tlenu z powodu zmniejszonej perfuzji krwi), niewydolność serca oraz zaburzenia naczyniowe, w tym zaburzenia pola widzenia, zawroty głowy i szumy uszne. Pod względem farmakologicznym trimetazydyna jest klasyfikowana jako inhibitor utleniania kwasów tłuszczowych, który zmniejsza zapotrzebowanie na tlen poprzez przestawienie metabolizmu z lipidów na glukozę, co zwiększa zużycie glukozy. Jednak dowody dotyczące dokładnego mechanizmu działania pozostają kontrowersyjne.

Trimetazydyna jest dostępna wyłącznie w postaci tabletek i zazwyczaj stosowana dwa razy dziennie (2 × 35 mg) lub trzy razy dziennie (3 × 20 mg). Lek nie jest zatwierdzony przez FDA, ale można go uzyskać w większości krajów europejskich (np. jako Vastarel® we Francji od 1978 roku). Trimetazydyna jest szybko wchłaniana z przewodu pokarmowego, a obecność pokarmu nie wpływa na jej biodostępność. Dane farmakokinetyczne i farmakodynamiczne są ograniczone w literaturze medycznej, a dostępne informacje należy interpretować ostrożnie, ponieważ większość badań przeprowadzono na chorych i starszych pacjentach. Średnie szczytowe stężenie w osoczu (Cmax) osiągano w ciągu 2,1 godziny w kontrolowanym badaniu po doustnym podaniu 20 mg. Niezależnie od pojedynczego czy wielokrotnego podania, okres półtrwania trimetazydyny wynosi około 6 godzin. Inni naukowcy stwierdzili dłuższy okres półtrwania wynoszący od 7 do 12 godzin, szczególnie u starszej populacji.

Pojedyncza doustna dawka znakowanej radioaktywnie trimetazydyny u ludzi jest wydalana w 79%-84% z moczem w ciągu 24 godzin. Trimetazydyna jest częściowo biotransformowana do kilku metabolitów, które wykryto tylko w moczu, a nie we krwi. Produkty wydalania z moczem obejmują 60% niezmienionego leku. Według Sigmunda i wsp., chociaż metabolity (demetylowana trimetazydyna i odpowiedni sulfo-koniugat, okso-trimetazydyna i N-tlenek trimetazydyny) zostały zidentyfikowane w próbkach kontroli antydopingowej, macierzysta trimetazydyna została zidentyfikowana w wyższych stężeniach. Dlatego lek macierzysty wydaje się być docelowym lekiem do badania w próbkach biologicznych, szczególnie w kontroli antydopingowej.

W kontrolowanym badaniu po pojedynczym doustnym podaniu tabletki 35 mg, szczytowe stężenie w moczu uzyskano 4 godziny po spożyciu, ze stężeniami w zakresie od 23 000 do 59 000 ng/ml, które spadły do 1000-9200 ng/ml po 24 godzinach. Biorąc pod uwagę te stężenia w moczu po pojedynczej ekspozycji, nie jest zaskakujące, że sportowcy kwestionują naruszenie przepisów antydopingowych, gdy szacowane stężenia trimetazydyny w moczu są niższe niż 5 ng/ml lub nawet niższe niż 1 ng/ml.

Czy trimetazydyna budzi kontrowersje w kontekście antydopingu?

Zgodnie z listą substancji zakazanych na rok 2024 Światowej Agencji Antydopingowej (WADA), trimetazydyna jest substancją niespecyficzną, zakazaną przez cały czas (w trakcie i poza zawodami) i znajduje się w klasie S4 modulatorów hormonalnych i metabolicznych, konkretnie S4.4.4 modulatorów metabolicznych. Spośród 2680 niekorzystnych wyników analitycznych (AAF) zgłoszonych w 2022 roku przez WADA, trimetazydynę zidentyfikowano w 18 przypadkach. Chociaż nadal istnieją kontrowersje dotyczące potencjału trimetazydyny do poprawy wyników sportowych, lek był promowany jako środek dopingujący w niektórych krajach. Jednak trimetazydyna jest znana z wywoływania wyraźnych skutków ubocznych, w tym parkinsonizmu, zaburzeń chodu i drżenia. Teoretycznie te efekty powinny zapobiegać stosowaniu leku w sporcie.

Ze względu na brak cytowań w PubMed, Web of Science i ScienceDirect z kluczowymi słowami “włosy i trimetazydyna”, opracowano specjalną metodę wykorzystującą chromatografię cieczową sprzężoną z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS). W badaniu wykorzystano różne odczynniki chemiczne, w tym mrówczan amonu 99%, di-natriumtetraborat-dekahydrat, acetonitryl klasy LC-MS, metanol, heksan, eter dietylowy, dichlorometan i alkohol izoamylowy. Trimetazydyna i trimetazydyna-D8 zostały zakupione od Cayman Chemical. Rozcieńczenia w metanolu były używane do przygotowania roztworów roboczych trimetazydyny i standardu wewnętrznego.

W ramach badania samoeksperymetnalnego jeden z autorów (mężczyzna, 63 lata, 86 kg) spożył 1 tabletkę 20 mg (Vastarel® 20 mg) ze 100 ml wody z kranu. Próbkę włosów (3 cm, jasnobrązowe) pobrano dokładnie 4 tygodnie po spożyciu i przechowywano w ciemności, w temperaturze pokojowej, do analizy. We Francji zatwierdzenie przez lokalną komisję etyczną nie jest wymagane w przypadku eksperymentów na sobie, z wyjątkiem narkotyków (nie dotyczy trimetazydyny).

Jak przeprowadzić analizę trimetazydyny we włosach?

W ciągu ostatnich 2 lat kilku sportowców (n = 5) dostarczyło próbkę włosów do identyfikacji trimetazydyny, ponieważ kwestionowali naruszenie przepisów antydopingowych. Strategia polegała na objęciu okresu AAF na podstawie średniej szybkości wzrostu włosów wynoszącej 1 cm na miesiąc i testowaniu leku poprzez segmentację 2-3 miesiące przed i 2-3 miesiące po, aby ustalić wzorzec ekspozycji. Gdy próbka włosów była pobierana w laboratorium, tożsamość dawcy była kontrolowana przez jego/jej paszport. Gdy włosy otrzymywano kurierem, obecny był kompletny łańcuch dowodowy, a procedura pobierania była rejestrowana na wideo.

Przygotowanie włosów obejmowało dekontaminację 2 razy 5 ml dichlorometanu przez 2 min. Następnie włosy były segmentowane zgodnie z każdym przypadkiem. Każdy segment był cięty na bardzo małe kawałki (<0,5 mm) małymi nożyczkami. Nie stosowano pulweryzacji w młynie kulowym, aby uniknąć możliwego zanieczyszczenia ze względu na lepką naturę niektórych próbek włosów. Dwadzieścia miligramów materiału włosowego było inkubowane przez noc w 1 ml buforu boranowego o pH 9,5 w temperaturze 40°C w obecności 1 ng trimetazydyny-D8, używanej jako standard wewnętrzny. Trimetazydynę i standard wewnętrzny ekstrahowano 5 ml eteru dietylowego/dichlorometanu/heksanu/alkoholu izoamylowego (50/30/20/0,5, v/v) przez 15 min. Po odwirowaniu supernatanty były ostrożnie odparowywane do sucha pod strumieniem azotu. Pozostałość rekonstytuowano w 30 μl fazy ruchomej A. Objętość wstrzyknięcia wynosiła 2 μl.

Separację chromatograficzną przeprowadzono na chromatografie cieczowym o ultra-wysokiej wydajności Waters Acquity I-class. Separację leków uzyskano przy użyciu kolumny Waters Acquity HSS C18 (150 mm × 2,1 mm, 1,8 μm) utrzymywanej w temperaturze 50°C (termostatycznie kontrolowany piec). Zastosowano elucję gradientową z 2 fazami: buforem mrówczanowym dostosowanym do pH 3,0 (faza ruchoma A) i 0,1% kwasem mrówkowym w acetonitrylu (faza ruchoma B). Prędkość przepływu była stała i wynosiła 0,40 ml/min. Początkowy gradient wynosił 87% fazy A przez 0,5 min, następnie zmniejszał się do 50% przez 10 min. Następnie następował spadek do 5% w ciągu 0,75 min, który był utrzymywany przez 1,5 min. W 12,5 min powracały warunki początkowe i były utrzymywane przez 2,5 min. Elektrorozpylacz był ustawiony w trybie jonizacji dodatniej (ESI+). Do detekcji trimetazydyny i standardu wewnętrznego użyto spektrometru mas potrójnego kwadrupola Xevo TQS micro firmy Waters. Zastosowano następujące warunki: temperatura bloku źródłowego 150°C; napięcie kapilary 2,5 kV; desolwatacja azotem podgrzanym do 600°C i dostarczanym z prędkością 1000 l/h.

Metoda ta umożliwia wykrywanie trimetazydyny we włosach z limitem detekcji 0,1 pg/mg i limitem kwantyfikacji 1 pg/mg. Walidacja metody wykazała dobrą liniowość w zakresie od 1 do 200 pg/mg (r² = 0,9987), akceptowalną precyzję wewnątrz- i międzydniową (współczynniki zmienności zawsze poniżej 20%), względny odzysk 79% oraz efekty matrycowe mniejsze niż 20%. Analiza stabilności wykazała, że analityki były stabilne w autosamplerze chłodzonym do +10°C przez co najmniej 36 godzin. Nie zaobserwowano żadnych interferencji z endogennego materiału włosowego w czasach retencji trimetazydyny i standardu wewnętrznego.

Jak interpretować wyniki testów włosów u sportowców?

W badaniu z udziałem pięciu sportowców kwestionujących naruszenie przepisów antydopingowych, przygotowano segmenty włosów o długości 1 cm, aby objąć okres AAF, przyjmując średnią szybkość wzrostu włosów wynoszącą 1 cm na miesiąc. We wszystkich pięciu przypadkach stężenia trimetazydyny były poniżej 1 pg/mg. Nie jest to granica decyzyjna, ale limit kwantyfikacji, który jest pierwszym punktem krzywej kalibracyjnej. Jednak w niektórych przypadkach zaobserwowano sygnał między limitem detekcji (0,1 pg/mg) a limitem kwantyfikacji (1 pg/mg), wyraźnie wykazujący ekspozycję na trimetazydynę. Włókna włosów mogą być narażone na naturalne czynniki środowiskowe, takie jak światło słoneczne, woda, zanieczyszczenia itp., oraz na zabiegi kosmetyczne, takie jak trwała ondulacja, farbowanie, rozjaśnianie i aplikacja termiczna, które mogą uszkodzić keratynową osłonkę. Dlatego zadbano o to, aby pod mikroskopem optycznym zweryfikować integralność dostarczonych próbek (brak uszkodzeń osłonki włosa). Żaden z sportowców nie zadeklarował wykonania zabiegu kosmetycznego w okresie AAF.

Aby określić, czego można oczekiwać po pojedynczej ekspozycji terapeutycznej, jeden z autorów samodzielnie przyjął pojedynczą dawkę 20 mg i zebrał swoje włosy 4 tygodnie po podaniu. Trimetazydyna dała wynik pozytywny w proksymalnym segmencie włosów na poziomie 146 pg/mg. Zaobserwowano ograniczone przesunięcie leku do kolejnego segmentu, co można było przewidzieć, ponieważ trimetazydyna powinna być wykrywana tylko w segmencie proksymalnym. Ta dyfuzja osiowa została już opisana dla innych leków. Na podstawie tych wstępnych i ograniczonych (n = 1) wyników wydaje się, że możliwe jest rozróżnienie między przypadkową ekspozycją i jej odpowiedzią we włosach (poniżej 1 pg/mg) a pojedynczą ekspozycją na 20 mg trimetazydyny i jej odpowiedzią we włosach (146 pg/mg), biorąc pod uwagę bardzo dużą różnicę obserwowaną w odpowiedziach dla tych dwóch przeciwstawnych sytuacji. Ma to szczególne znaczenie przy dokumentowaniu przypadku dopingu, w którym podnoszona jest kwestia zanieczyszczenia.

W 2021 roku Thevis i wsp. opublikowali, że ze względu na rozwój bardzo czułych instrumentów sprzężonych z bardzo specyficznymi detektorami, mocz sportowców może być zanieczyszczony lekiem przez czynniki środowiskowe, i opracowali koncepcję eksposomu sportowca. W takich przypadkach stężenia leków w moczu są na niskich poziomach ng/ml. W związku z tym zaobserwowano rosnącą liczbę AAF, z szacunkowymi stężeniami bliskimi 1 ng/ml. Jednak niskie stężenie w moczu można interpretować różnie. Może to być końcowy etap dawki terapeutycznej stosowanej w celu poprawy wydajności lub pozostałości zanieczyszczenia. Ponieważ okres niekwalifikowalności różni się w zależności od sytuacji, ostatnio zaobserwowano, że liczni sportowcy kwestionowali naruszenie przepisów antydopingowych (ADRV), twierdząc, że obecność leku lub jego metabolitu(ów) wynika z zanieczyszczenia. Ustalono kilka rodzajów zanieczyszczeń, w tym zanieczyszczenie suplementów, zanieczyszczenie żywności (mięso, jaja, mleko), zanieczyszczenie lekami (głównie niesteroidowymi lekami przeciwzapalnymi) i przenoszenie leków podczas intymnych momentów.

Istotna różnica między sądem karnym a trybunałem sportowym polega na tym, że w przypadku władz sportowych zespół prawny musi wykazać niewinność sportowca, podczas gdy w sądzie karnym prokurator musi wykazać winę oskarżonego. Sportowiec, który nie przejdzie testu antydopingowego, jest zawieszony do czasu ustalenia braku winy lub zaniedbania. To odwrócenie zwykłych ciężarów dowodowych skłoniło prawników do zatrudnienia toksykologów sądowych w celu udokumentowania sprawy, podobnie jak w sądach karnych. Ponieważ badanie włosów na obecność narkotyków jest akceptowane jako dowód od 40 lat, naturalne było wprowadzenie go w sporcie, a niektóre laboratoria opracowały procedury testowania środków dopingujących we włosach.

Kluczowym punktem strategii obrony sportowca kwestionującego ADRV jest przeprowadzenie testu włosów, ponieważ test ten pozwoli ustalić wzorzec stosowania leku. Wyniki analizy włosów mogą pomóc w rozróżnieniu dopingu od innych scenariuszy, które mogą prowadzić do niekorzystnych wyników w próbkach moczu. Rzeczywiście, podczas gdy pozytywny wynik testu włosów przemawia za wielokrotnymi podaniami, negatywny wynik testu włosów bardziej wspiera stanowisko, że sportowiec nie był (lub nie w znacznym stopniu) narażony na określony lek. Oczywiście to stwierdzenie musi uwzględniać różnice we wbudowywaniu leków do włosów i musi być zrównoważone z tym, co zostało opublikowane w literaturze medycznej. Na przykład, pojedyncza ekspozycja na steryd anaboliczny nie pojawi się we włosach. Przeciwnie, w przypadku wielu leków alkalicznych, pojedyncza dawka terapeutyczna jest wykrywalna we włosach.

Mały sygnał chromatograficzny lub nawet brak sygnału chromatograficznego zaobserwowany we włosach pięciu sportowców można uznać za charakterystyczny dla zanieczyszczenia minimalnymi ilościami trimetazydyny, znacznie mniejszymi niż można oczekiwać po podaniu pojedynczej dawki terapeutycznej. Ponadto, całkiem niedawno Görgens i wsp. przedstawili na warsztatach, że trimetazydyna była wykrywalna we włosach dwóch osób przyjmujących lek w dawce dobowej 2× 35 mg na poziomie odpowiednio 880 i 350 pg/mg. W tym sensie negatywne wyniki testów włosów 5 sportowców odpowiadają niezamierzonej ekspozycji nieterapeutycznej, biorąc pod uwagę dużą skalę między wynikami ich testów włosów a tym, co można zaobserwować po podaniu pojedynczej dawki.

Podsumowując, każdego roku zgłaszanych jest kilka niekorzystnych wyników analitycznych dotyczących trimetazydyny. Ponieważ laboratorium zostało poproszone przez kilku sportowców o przetestowanie trimetazydyny we włosach, autorzy opracowali oryginalną metodę. Przedstawione dane analityczne dostarczają istotnych informacji dla interpretacji wyników w przypadkach dopingu sportowego, szczególnie dla trimetazydyny.

Podsumowanie

Trimetazydyna jest lekiem przeciwniedokrwiennym działającym poprzez inhibicję utleniania kwasów tłuszczowych i przestawienie metabolizmu na glukozę. Stosowana jest w dawkach 2 × 35 mg lub 3 × 20 mg dziennie w leczeniu chorób serca. Lek charakteryzuje się szybkim wchłanianiem z przewodu pokarmowego, osiągając szczytowe stężenie w osoczu po około 2 godzinach, z okresem półtrwania 6-12 godzin. Jest wydalany głównie z moczem, w 60% w formie niezmienionej. Światowa Agencja Antydopingowa (WADA) umieściła trimetazydynę na liście substancji zakazanych jako modulator metaboliczny. W celu wykrywania leku w organizmie sportowców opracowano specjalistyczną metodę analizy włosów wykorzystującą chromatografię cieczową sprzężoną ze spektrometrią mas. Badania wykazały, że możliwe jest rozróżnienie między przypadkową ekspozycją (stężenie poniżej 1 pg/mg) a celowym przyjmowaniem leku (stężenie około 146 pg/mg po pojedynczej dawce), co ma kluczowe znaczenie w dokumentowaniu przypadków dopingu.