Dapagliflozyna i trimetazydyna chronią wątrobę diabetyków

Czy inhibitory SGLT2 chronią wątrobę diabetyków leczonych doxorubicyną?

Współwystępowanie cukrzycy i nowotworów stanowi rosnący problem kliniczny – według najnowszych danych epidemiologicznych niemal jedna czwarta (24,4%) pacjentów onkologicznych w Stanach Zjednoczonych choruje równocześnie na cukrzycę typu 2. Ta koincydencja nie tylko pogarsza rokowanie, ale również zwiększa wrażliwość na toksyczne działanie chemioterapii. Szczególnie istotne jest to w kontekście stosowania doxorubicyny – antracykliny będącej podstawą leczenia wielu nowotworów, która u diabetyków częściej wywołuje uszkodzenie narządów, w tym wątroby.

Doxorubicyna, choć skuteczna w terapii raka piersi, chłoniaków i mięsaków, wywołuje poważne działania niepożądane, głównie kardio- i hepatotoksyczność, mediowane przez stres oksydacyjny, stan zapalny i aktywację szlaków apoptotycznych. Jednocześnie cukrzyca – modelowana eksperymentalnie przez podanie streptozotocyny (STZ) – sama w sobie prowadzi do przewlekłej hiperglikemii i uszkodzenia wątroby. Połączenie obu czynników może nasilać hepatotoksyczność poprzez wzmożony stres oksydacyjny i odpowiedź zapalną.

Dapagliflozyna, inhibitor kotransportera sodowo-glukozowego typu 2 (SGLT2), oprócz działania hipoglikemizującego wykazuje obiecujące właściwości hepatoprotekcyjne w modelach stłuszczeniowego zapalenia wątroby i uszkodzenia indukowanego tetrachlorkiem węgla. Trimetazydyna z kolei – metaboliczny lek przeciwniedokrwienny – w badaniach doświadczalnych chroniła wątrobę przed uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym i hepatotoksycznością doxorubicyny, głównie poprzez tłumienie stresu oksydacyjnego i aktywności kaspazy-3.

Dotychczas żadne badanie nie porównało bezpośrednio indywidualnych i skojarzonych efektów dapagliflozyny i trimetazydyny w modelu łączącym cukrzycę STZ-zależną i uszkodzenie wątroby wywołane doxorubicyną. Autorzy postawili hipotezę, że kombinacja obu leków może zapewniać komplementarną hepatoprotekcję dzięki odmiennym mechanizmom działania – dapagliflozyna działa głównie przeciwzapalnie i przeciwwłóknieniowo, trimetazydyna natomiast poprawia mitochondrialną efektywność energetyczną i ogranicza apoptozę zależną od kaspazy-3.

Jak zaprojektowano eksperyment oceniający ochronę wątroby?

Badanie przeprowadzono na archiwizowanych próbkach tkanek wątrobowych pochodzących z wcześniej zatwierdzonego eksperymentu oceniającego uszkodzenie serca u szczurów diabetycznych. Protokół został zatwierdzony przez Komisję Etyczną ds. Doświadczeń na Zwierzętach Uniwersytetu Recep Tayyip Erdogan (nr 2022/16, 26 kwietnia 2022 r.), a wszystkie procedury realizowano zgodnie z wytycznymi ARRIVE.

Do badania włączono 48 samców szczurów Sprague Dawley w wieku 6–8 tygodni i masie ciała około 210 ± 30 g, które randomizowano do sześciu grup (n=8/grupę): Grupa 1 (kontrola) – bez interwencji; Grupa 2 (STZ) – jednorazowe dootrzewnowe podanie streptozotocyny 55–60 mg/kg (cukrzyca potwierdzona glikemią >250 mg/dl po 72 h); Grupa 3 (STZ + DOXO) – po indukcji cukrzycy doxorubicyna 5 mg/kg i.p. raz w tygodniu przez 4 tygodnie (dawka kumulacyjna 20 mg/kg); Grupa 4 (STZ + DOXO + TMZ) – jak grupa 3, następnie trimetazydyna doustnie 10 mg/kg/dobę przez 14 dni; Grupa 5 (STZ + DOXO + DAPA) – jak grupa 3, następnie dapagliflozyna doustnie 10 mg/kg/dobę przez 14 dni; Grupa 6 (STZ + DOXO + TMZ + DAPA) – terapia skojarzona obiema substancjami przez 14 dni.

Leczenie rozpoczynano tydzień po ostatniej dawce doxorubicyny. Po 24 godzinach od ostatniego podania leków wszystkie zwierzęta uśmiercano w głębokiej anestezji (ketamina 50 mg/kg + ksylazyna 10 mg/kg), a tkanki wątrobowe pobierano do analiz histopatologicznych (utrwalanie w 10% formalinie buforowanej), immunohistochemicznych (TNF-α, 8-OHdG, kaspaza-3, TGF-β, TUNEL, NF-κB/p65) oraz biochemicznych (MDA, zredukowany GSH). Całkowity czas trwania eksperymentu wynosił 6 tygodni od indukcji cukrzycy.

Ocenę histopatologiczną przeprowadził doświadczony histopatolog w sposób zaślepiony, stosując półilościową skalę punktową uwzględniającą zwyrodnienie hepatocytów, martwicę, stłuszczenie i zastój naczyniowy (0–4 punkty za każdy parametr). Poziomy MDA i GSH oznaczano spektrofotometrycznie w homogenatach tkankowych. Immunohistochemię wykonano metodą streptawidyna-peroksydaza z wizualizacją DAB, a intensywność barwienia oceniano półilościowo (0–4 punkty).

Analizę statystyczną przeprowadzono w SPSS 25.0. Rozkład normalny sprawdzano testem Shapiro-Wilka, a jednorodność wariancji testem Levene’a. Dane parametryczne porównywano jednoczynnikową ANOVA z testem post hoc Tamhane’a T2 (dla nierównych wariancji) lub Bonferroniego (dla AST). Dane nieparametryczne analizowano testem Kruskala-Wallisa z korektą Dunna-Bonferroniego. Za istotne uznawano p<0,05. Obliczono wielkości efektu (η²) i moc post hoc, która we wszystkich przypadkach przekroczyła 0,90.

Jakie zmiany biochemiczne obserwowano w wątrobie?

Analiza porównawcza sześciu grup wykazała istotne statystycznie różnice we wszystkich czterech analizowanych parametrach biochemicznych: MDA, GSH, AST i ALT. Test Levene’a potwierdził jednorodność wariancji tylko dla AST (p>0,05), natomiast MDA, GSH i ALT wykazały istotną heterogeniczność (p<0,05), co wymagało zastosowania testu Tamhane'a T2 do porównań parami. Ze względu na stosunkowo małą liczebność próby (n=8/grupę) dodatkowo obliczono wielkości efektu (η²) oraz moc post hoc, która we wszystkich przypadkach przekroczyła 0,90, potwierdzając wystarczającą czułość do wykrycia prawdziwych różnic międzygrupowych.

Poziomy MDA różniły się istotnie między grupami (F(5,42)=3,610, p=0,008) z dużą wielkością efektu (η²=0,301), co oznacza, że 30,1% wariancji wynikało z różnic grupowych. MDA był istotnie podwyższony w grupie STZ w porównaniu z kontrolą (78,88 ± 17,2 vs 62,30 ± 10,3 nmol/g, p<0,05), co wskazuje na nasiloną peroksydację lipidów. Interesujące, że grupa STZ + DOXO wykazała nieco niższe wartości MDA (67,36 ± 11,5), a zarówno trimetazydyna (55,40 ± 11,8), jak i terapia skojarzona (62,37 ± 2,7) obniżyły MDA jeszcze bardziej – w grupie kombinowanej do poziomu porównywalnego z kontrolą.

Stężenia GSH również różniły się istotnie (F(5,42)=3,918, p=0,005) z wielkością efektu η²=0,318 i mocą 0,948. GSH był znacząco obniżony w grupie STZ (6,51 ± 1,3) w porównaniu z kontrolą (7,43 ± 1,0, p<0,05), potwierdzając wyczerpanie antyoksydantów wywołane stresem oksydacyjnym. Nieoczekiwanie, w grupie STZ + DOXO zaobserwowano umiarkowany wzrost GSH (7,61 ± 1,4), co może sugerować kompensacyjną aktywację endogennych mechanizmów antyoksydacyjnych. Leczenie trimetazydyną (10,02 ± 3,0) lub terapią skojarzoną (7,23 ± 2,0) istotnie podnosiło poziomy GSH, przy czym grupa TMZ wykazała najsilniejszy wzrost.

Aktywność AST wykazała bardzo istotny efekt grupowy (F(5,42)=20,041, p<0,001) z bardzo dużą wielkością efektu (η²=0,705) i mocą 1,000. Porównania parami z korektą Bonferroniego ujawniły, że AST był wyraźnie podwyższony w grupach STZ (485 ± 120) i STZ + DOXO (203 ± 83) w porównaniu z kontrolą (157 ± 36, p<0,001). Grupa 2 (STZ) miała istotnie wyższy AST niż grupy 1, 3, 5 i 6, podobnie grupa 4 (STZ + DOXO + TMZ). Dapagliflozyna (grupa 5) i terapia skojarzona (grupa 6) obniżyły AST do wartości zbliżonych do kontrolnych.

Aktywność ALT również była istotnie zależna od warunków eksperymentalnych (F(5,42)=13,796, p<0,001) z η²=0,622 i mocą 1,000. ALT był wyraźnie podwyższony w grupach STZ (201 ± 78) i STZ + DOXO (104 ± 44) w porównaniu z kontrolą (65 ± 9, p<0,001). Trimetazydyna nie poprawiła istotnie ALT (grupa 4: 188 ± 42), natomiast dapagliflozyna (64 ± 17) i terapia skojarzona (92 ± 51) skutecznie obniżyły stężenia ALT, przy czym dapagliflozyna była szczególnie efektywna w przywracaniu ALT do wartości wyjściowych.

Jak leki wpłynęły na mikroskopowy obraz wątroby?

Całkowity wskaźnik uszkodzenia histopatologicznego wątroby (LDS) był istotnie podwyższony w grupach STZ i STZ + DOXO (odpowiednio 8 (8–9) i 10 (9–11) punktów) w porównaniu z grupą kontrolną (0 (0–0) punktów, p<0,001). W grupach tych wyraźnie obecne były cechy histologiczne takie jak zwyrodnienie wewnątrzpłatowe, martwica pomostowa okołowrotna, stłuszczenie hepatocytów (obecność wakuol lipidowych w cytoplazmie) oraz zastój naczyniowy.

Leczenie trimetazydyną i dapagliflozyną istotnie poprawiło wszystkie parametry histopatologiczne, przy czym terapia skojarzona wykazała największą poprawę, redukując LDS do 2,5 (2–3) punktów (p<0,001 vs grupa STZ + DOXO). Analiza poszczególnych komponentów ujawniła, że korzyści z terapii łączonej były najbardziej widoczne w przypadku stłuszczenia i zastoju naczyniowego, podczas gdy punkty końcowe biochemiczne nie wykazały spójnej przewagi nad samą dapagliflozyną.

Obserwacje mikroskopowe potwierdziły, że zarówno cukrzyca, jak i ekspozycja na doxorubicynę wywołują rozległe zmiany degeneracyjne, martwicze i zapalne w miąższu wątroby. Obecność wakuol lipidowych wskazuje na zaburzenia metabolizmu tłuszczów typowe dla stanu przedcukrzycowego i cukrzycy. Zastój w zatokach wątrobowych może odzwierciedlać zarówno bezpośrednie uszkodzenie śródbłonka, jak i wtórne zaburzenia mikrokrążenia związane z dysfunkcją metaboliczną.

Które szlaki molekularne uległy modyfikacji pod wpływem leczenia?

Ocena immunohistochemiczna wykazała istotne podwyższenie ekspresji wszystkich sześciu badanych markerów w grupach STZ i STZ + DOXO w porównaniu z kontrolą (p<0,05), potwierdzając nasiloną apoptozę, uszkodzenie oksydacyjne DNA, stan zapalny i włóknienie. Trimetazydyna i dapagliflozyna, zarówno w monoterapii, jak i w skojarzeniu, istotnie obniżyły intensywność barwienia wszystkich analizowanych białek.

Kaspaza-3 – kluczowy efektorowy enzym apoptozy – wykazywała intensywne barwienie w grupach STZ i STZ + DOXO (mediana 3 (2–3) punkty), które spadło do 1 (0–1) punktu po leczeniu, przy czym największą redukcję obserwowano w grupie otrzymującej terapię skojarzoną (p<0,001 vs STZ + DOXO). Podobny wzorzec zaobserwowano w teście TUNEL, który bezpośrednio wizualizuje fragmentację DNA w apoptotycznych hepatocytach – liczba komórek TUNEL-dodatnich była znacząco wyższa w grupach STZ i STZ + DOXO, a wyraźnie niższa po zastosowaniu DAPA, TMZ i szczególnie terapii kombinowanej.

8-hydroksydeoksyguanozyna (8-OHdG) – marker oksydacyjnego uszkodzenia DNA – również uległa wyraźnej redukcji: z 3 (2–3) punktów w grupach nieleczonych do 1 (1–2) punktu po terapii. Dapagliflozyna była skuteczniejsza w obniżaniu ekspresji 8-OHdG niż trimetazydyna, co korelowało z jej wpływem na ALT i sugeruje silniejsze działanie cytoprotektywne na poziomie integralności genomowej hepatocytów.

TNF-α i NF-κB/p65 – kluczowe mediatory odpowiedzi zapalnej – wykazywały intensywne barwienie jądrowe i cytoplazmatyczne w grupach STZ i STZ + DOXO (mediana 3 (2–3) punkty), co wskazuje na aktywację zapalnych kaskad transkrypcyjnych. Oba leki istotnie obniżyły immunopozytywność TNF-α (do 1 (1–2) punktu) i NF-κB/p65 (do 1 (0–1) punktu), przy czym najsilniejsze tłumienie obserwowano w grupie kombinowanej (p<0,001 vs STZ + DOXO). Wynik ten sugeruje skuteczną supresję szlaków NF-κB-zależnych cytokin prozapalnych.

TGF-β1 – centralny mediator fibrogeneza wątrobowej – był wyraźnie podwyższony w grupach STZ i STZ + DOXO (mediana 2 (2–3) punkty), odzwierciedlając zarówno efekt profibrotyczny, jak i jego powiązanie z sygnalizacją zapalną. Cytokiny prozapalne takie jak TNF-α i IL-1β stymulują ekspresję TGF-β, który z kolei wzmaga rekrutację komórek immunologicznych i uwalnianie cytokin, tworząc błędne koło zapalenia i włóknienia. Oba leki znacząco obniżyły ekspresję TGF-β1, przy czym terapia skojarzona wykazała najsilniejszą supresję (0,5 (0–1) punktu, p<0,001 vs STZ + DOXO), co sugeruje przerwanie tego cyklu.

Jednoczesne obniżenie NF-κB/p65 w badaniu wspiera tę interpretację, ponieważ NF-κB jest krytycznym regulatorem upstream dla TNF-α i TGF-β. Razem wzięte, wyniki wskazują, że obserwowana hepatoprotekcja obejmuje skoordynowaną inhibicję szlaków apoptotycznych (TUNEL, kaspaza-3) i zapalnych (NF-κB, TNF-α).

Dlaczego kombinacja leków może być korzystna?

Wyniki wskazują, że efekty ochronne dapagliflozyny i trimetazydyny były w dużej mierze komplementarne, a nie synergiczne, ponieważ każdy lek wydawał się celować w odrębne szlaki uszkodzenia hepatocytów. Dapagliflozyna najskuteczniej obniżała transaminazy i redukowała apoptozę oraz oksydacyjne uszkodzenie DNA, co jest zgodne z jej profilem hepatoprotekcyjnym i doniesieniami o poprawie transaminaz oraz bezpieczeństwie w stłuszczeniu i marskości wątroby. Mechanistycznie może to wynikać z działania stabilizującego błony komórkowe i przeciwzapalnego.

Trimetazydyna z kolei wykazała silniejsze bezpośrednie efekty antyoksydacyjne – obniżała MDA i podnosiła GSH bardziej niż dapagliflozyna, co jest zgodne z jej rolą w zachowaniu funkcji mitochondrialnej, redukcji utleniania kwasów tłuszczowych i ograniczaniu wybuchów oksydacyjnych. Chociaż dapagliflozyna jest mechanistycznie powiązana z syntezą GSH zależną od AMPK/Nrf2, wzrosty GSH były skromne, prawdopodobnie z powodu czynników farmakokinetycznych lub pośrednich systemowych.

Interesujące, grupa STZ + DOXO wykazała paradoksalne wyniki biochemiczne – niższe ALT i AST oraz zredukowane MDA przy jednoczesnym wzroście GSH, mimo wyraźnych dowodów histopatologicznych i immunohistochemicznych na uszkodzenie wątroby. Jednym z możliwych wyjaśnień jest to, że doxorubicyna może preferencyjnie indukować apoptotyczną, a nie nekrotyczną śmierć komórki, ograniczając tym samym pękanie błon, wyciek transaminaz i peroksydację lipidów. W przeciwieństwie do tego, hiperglikemia wywołana STZ promuje martwicę hepatocytów, stres oksydacyjny i uwalnianie enzymów.

Kompensacyjne odpowiedzi antyoksydacyjne, potencjalnie obejmujące zwiększenie syntezy glutationu mediowane przez Nrf2, mogły również przyczynić się do stabilizacji błon hepatocytów pod wpływem stresu doxorubicynowego. Należy jednak podkreślić, że pozostaje to spekulacją, ponieważ Nrf2 ani jego cele downstream nie były oceniane w tym badaniu. Alternatywne wyjaśnienia, w tym ograniczenia metodologiczne testu TBARS oraz czas pobrania tkanek (przejściowe wzrosty oksydacyjne lub transaminaz mogły opaść przed pobraniem próbek), również powinny być rozważone.

Kombinacja obu leków nie przewyższyła dapagliflozyny w zakresie punktów końcowych biochemicznych, co wspiera częściową komplementarność, a nie synergię. Korzyści z terapii łączonej były najbardziej widoczne w przypadku stłuszczenia i zastoju naczyniowego – co jest zgodne z doniesieniami, że dapagliflozyna ogranicza akumulację lipidów wątrobowych i stan zapalny poprzez FoxO1 i SREBP-1c, a trimetazydyna redukuje uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne poprzez wsparcie produkcji ATP.

Co te wyniki mogą oznaczać dla praktyki onkologicznej?

Wyniki sugerują, że efekty hepatoprotekcyjne dapagliflozyny mogą wykraczać poza jej znane działania metaboliczne, jednak czy ma to implikacje dla uszkodzenia wątroby związanego z chemioterapią, wymaga dalszego potwierdzenia. Obserwacje są zgodne z doniesieniami o wielonarządowej protekcji przez inhibitory SGLT2, chociaż jakakolwiek translacja kliniczna pozostaje spekulacyjna. Dodanie trimetazydyny mogło przyczynić się do tych efektów ochronnych – odkrycie, które zasługuje na dalsze badania mechanistyczne, choć jego znaczenie kliniczne nie może być wnioskowane z tego badania pilotażowego.

Wstępne dane sugerują możliwość, że łączenie leków o nienakładających się mechanizmach może oferować szerszą ochronę w złożonych modelach uszkodzenia, jednak czy ma to jakiekolwiek znaczenie kliniczne, pozostaje niepewne. Brak wyraźnej synergii sugeruje, że korzyść z takiej kombinacji może leżeć w addytywnej protekcji, a nie wzmocnieniu indywidualnych efektów. Przyszłe badania translacyjne powinny zatem skupić się na tym, czy terapia skojarzona przynosi klinicznie znaczące korzyści – takie jak lepsza tolerancja chemioterapii lub zmniejszona progresja uszkodzenia wątroby – wykraczające poza te osiągnięte przez leczenie pojedynczym lekiem.

Szczególnie istotne może to być dla pacjentów z cukrzycą otrzymujących anthracykliny, u których współistnienie zaburzeń metabolicznych i toksyczności lekowej stwarza wyjątkowe wyzwanie terapeutyczne. Obecnie brak jest specyficznych wytycznych dotyczących hepatoprotekcji w tej populacji, a rutynowe monitorowanie transaminaz często wykrywa uszkodzenie zbyt późno. Potencjalna możliwość profilaktycznego zastosowania dapagliflozyny u diabetyków kwalifikujących się do chemioterapii wymaga jednak weryfikacji w prospektywnych badaniach klinicznych.

Jakie są główne ograniczenia tego eksperymentu?

Badanie ma kilka istotnych ograniczeń, które należy uwzględnić przy interpretacji wyników. Po pierwsze, konieczna jest ostrożność przy ekstrapolacji wyników z modeli zwierzęcych do kontekstu klinicznego – szczury różnią się od ludzi pod względem metabolizmu leków, odpowiedzi immunologicznej i dynamiki uszkodzenia wątroby. Analizy immunohistochemiczne nie zostały zwalidowane metodami molekularnymi takimi jak RT-PCR czy Western blot, a zbadano tylko dwa markery dla każdego procesu (zapalenie: TNF-α, NF-κB; apoptoza: kaspaza-3, TUNEL).

Włączenie szerszego panelu markerów (np. IL-6, IL-1β, Bax, Bcl-2, cytochrom c) dostarczyłoby bardziej kompleksowego obrazu mechanistycznego. Kolejnym ograniczeniem jest użycie archiwizowanych tkanek pierwotnie zebranych do badania kardiotoksyczności – chociaż dawkowanie, czas trwania i liczba zwierząt były zgodne ze standardowymi modelami hepatotoksyczności, projekt i obliczenia mocy nie były prospektywnie dostosowane do wyników wątrobowych.

Ponadto glikemię mierzono tylko raz po indukcji STZ, a nie prowadzono długoterminowego monitorowania glikemicznego, zatem efekt hipoglikemizujący dapagliflozyny pozostaje potencjalnym czynnikiem zakłócającym. Jako badanie pilotażowe, nie wykluczono wartości odstających, nie przeprowadzono analiz wrażliwości, a korekty wielokrotności stosowano niespójnie (Bonferroni dla AST, Welch ANOVA/Tamhane T2 dla pozostałych).

Co więcej, włączono tylko samce szczurów, co uniemożliwia ocenę różnic związanych z płcią – kwestia istotna, ponieważ metabolizm hormonalny może wpływać zarówno na hepatotoksyczność doxorubicyny, jak i odpowiedź na leczenie. Chociaż punktację histopatologiczną przeprowadził pojedynczy zaślepiony patolog, a TBARS jest szeroko stosowany do oceny peroksydacji lipidów, oba podejścia mają wrodzone ograniczenia. Wzięte razem, czynniki te podkreślają potrzebę przyszłych badań z większymi, prospektywnie zaprojektowanymi grupami, włączeniem obu płci oraz molekularną walidacją szlaków mechanistycznych.

Czy warto rozważyć kombinację dapagliflozyny i trimetazydyny w praktyce?

Badanie dostarcza wstępnych dowodów, że dapagliflozyna i trimetazydyna mogą wywierać komplementarne efekty hepatoprotekcyjne w eksperymentalnym modelu cukrzycy i uszkodzenia wątroby wywołanego doxorubicyną. Wyniki wskazują, że dapagliflozyna skuteczniej normalizuje transaminazy i redukuje apoptozę oraz oksydacyjne uszkodzenie DNA, podczas gdy trimetazydyna silniej moduluje stres oksydacyjny poprzez zwiększenie GSH i redukcję MDA. Terapia skojarzona przyniosła dodatkowe korzyści strukturalne, obniżając całkowity wskaźnik uszkodzenia histopatologicznego z 10 do 2,5 punktu.

Niemniej jednak wyniki należy interpretować ostrożnie ze względu na ograniczenia metodologiczne, a jakakolwiek ekstrapolacja kliniczna lub mechanistyczna pozostaje spekulacyjna. Przyszłe badania z większymi, prospektywnie zaprojektowanymi grupami, włączeniem obu płci oraz molekularną walidacją szlaków mechanistycznych są niezbędne do potwierdzenia tych wstępnych obserwacji. Szczególnie istotne będzie określenie, czy kombinacja leków przynosi klinicznie znaczące korzyści wykraczające poza monoterapię – takie jak lepsza tolerancja chemioterapii lub zmniejszona progresja uszkodzenia wątroby u pacjentów z cukrzycą poddawanych leczeniu anthracyklinami.